近期受木木兄的邀請(qǐng)，寫(xiě)一篇關(guān)于技術(shù)方面的小文，說(shuō)真的很激動(dòng)，這算是對(duì)于本人技術(shù)的一種認(rèn)可。想想在蛋白免疫診斷這個(gè)領(lǐng)域摸爬滾打混跡了8年，感覺(jué)現(xiàn)在的一切是那么的不易，那么的周折。
依稀記得08年正式開(kāi)始蛋白診斷試劑盒的研發(fā)，說(shuō)實(shí)話，那時(shí)候更多的是彷徨、無(wú)助，勝于新鮮感。最大的原因在于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)基本為零，技術(shù)開(kāi)發(fā)能力基本為零。或許后續(xù)的各位研友們有自己的理論知識(shí)和所謂的經(jīng)驗(yàn)之道，但是，本人在此善意提醒一句，除非您已經(jīng)真的從實(shí)踐中形成了一套自有的研發(fā)思路，要么您擁有堅(jiān)強(qiáng)的后盾導(dǎo)師，否則，請(qǐng)務(wù)必沉浸下來(lái)，好好的理清楚自己的思路。
具體思路的培養(yǎng)和形成我在此就不多說(shuō)了，僅從我個(gè)人角度聊下研發(fā)的大體思路環(huán)節(jié)，或許各位大大看的索然無(wú)味，再次抱歉。若是您有興趣愿意賞臉觀摩下我的歷程，那就請(qǐng)繼續(xù)下看。
很多新人進(jìn)入單位，開(kāi)始一個(gè)項(xiàng)目研發(fā)，或許都會(huì)跟我當(dāng)初一樣擁有迷茫感，那么請(qǐng)靜心做好以下幾個(gè)準(zhǔn)備：
1.請(qǐng)先大量查閱文獻(xiàn)，做到對(duì)該項(xiàng)目涉及的標(biāo)志物特性了如指掌，比如說(shuō)：該物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)/空間結(jié)構(gòu)，物理/化學(xué)性質(zhì)；
2.該標(biāo)志物在臨床中的診斷意義，該標(biāo)志物涉及的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)等確立該標(biāo)志物的基本性能指標(biāo)等信息；
3.準(zhǔn)備好以上資料并逐一理解之后，下面就開(kāi)始研發(fā)工藝思路的設(shè)計(jì)。
針對(duì)3.點(diǎn)，我舉一個(gè)常規(guī)例子來(lái)說(shuō)明：比如咱們開(kāi)發(fā)某一蛋白標(biāo)志物，如HCG（該標(biāo)志物為目前很成熟的一種產(chǎn)品，技術(shù)門檻較低，抗體原料也很容易獲得），在您已經(jīng)準(zhǔn)備好我所說(shuō)的1.和2.之后已經(jīng)知道該標(biāo)志物為一個(gè)大分子物質(zhì)，按照免疫學(xué)診斷方法學(xué)構(gòu)造劃分應(yīng)使用雙抗體夾心法，那么下一步我們就知道了，先去市場(chǎng)找該標(biāo)志物的抗體原料，最好的是有原料商給您提供配對(duì)好的抗體對(duì)，為什么這么說(shuō)？因?yàn)閷?duì)于你所找到的抗體，若是單個(gè)的原料，下一步您就需要多一步驟，即抗體配對(duì)，特別是對(duì)于新入行的兄弟們，這塊工作對(duì)于操作手法及配對(duì)方案的設(shè)計(jì)可能相對(duì)較為稚嫩，所以最好的就是讓原料商幫你把這部分工作做好，也減少了您的研發(fā)周期，另外，從原料后期采購(gòu)來(lái)說(shuō)，對(duì)于原料商，您購(gòu)買的品種和數(shù)量越多，給予您的折扣也相對(duì)理想，進(jìn)一步可以降低試劑盒開(kāi)發(fā)成本。當(dāng)然，事無(wú)全是，具體情況還需具體分析。特此提醒：有一些新標(biāo)志物產(chǎn)品特別是在剛上市之時(shí)，其實(shí)原料提供商真的很少，這個(gè)時(shí)候您就需要發(fā)揮極限能力，利用一切可利用資源，進(jìn)行全球搜捕吧，哈哈，或許運(yùn)氣好可以找到，對(duì)此尋求到的原料也很少有配對(duì)原料提供，若此，那只能遺憾的跟您說(shuō)，您準(zhǔn)備著手做下原材料配對(duì)工作吧！原料配對(duì)里面涉及的內(nèi)容太多，在此就不多敘說(shuō)了，若有興趣，咱們私下可慢聊。。。。。。
在此提醒各位研友，尋找的原料不能只有一家，至少需要找到3家以上，因?yàn)楹竺嬗幸豁?xiàng)很重要的工作需要你做，即：原材料篩選。最終獲得的適合您技術(shù)平臺(tái)的原料最好是為2家，一家以注冊(cè)申報(bào)為主，另一家作為您產(chǎn)品后期的備份原料供應(yīng)，這樣對(duì)于后期上市產(chǎn)品供應(yīng)的穩(wěn)定性有很大幫助。畢竟現(xiàn)在企業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)都很激烈，說(shuō)不得等您產(chǎn)品開(kāi)發(fā)出來(lái)再回頭去找該原料商發(fā)現(xiàn)已經(jīng)不存在，那就糗大了。注意一點(diǎn)：在尋找原料時(shí)候必須是原料商提供的原料信息中原料適用平臺(tái)里包含或者接近您的技術(shù)平臺(tái)，這一點(diǎn)至關(guān)重要！
上面說(shuō)了這么多，其實(shí)就是一個(gè)目的：為下面的正式研發(fā)工作做好鋪墊。在您尋找到對(duì)應(yīng)原料之后，第一步需要做的就是測(cè)試原料，一般原料到了之后需要先進(jìn)行初步性能評(píng)定，這個(gè)是需要結(jié)合您所設(shè)計(jì)的或者您所在單位所擁有的技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行綜合評(píng)估的。初步性能評(píng)定無(wú)非就是定量產(chǎn)品做下線性梯度、靈敏度等等，定性產(chǎn)品看下cut-off值附近的灰區(qū)范圍等等，每個(gè)研友都有自己的評(píng)定設(shè)想。具體內(nèi)容我就不累述了，嘿嘿，歡迎私下詳聊。
在您初步篩選出相對(duì)合適的原料后，那么下一步就是將該原料使用到您的技術(shù)平臺(tái)上，若是單位的技術(shù)平臺(tái)已經(jīng)很成熟，那就按照企業(yè)的技術(shù)平臺(tái)操作流程對(duì)應(yīng)的一步步去匹配試用即可；若是新平臺(tái)，那就要考慮幾個(gè)問(wèn)題，后期的各種不同標(biāo)志物如何磨合進(jìn)某一技術(shù)平臺(tái)中，這個(gè)時(shí)候需要做的就不是去匹配技術(shù)平臺(tái)，而是先各自按照一個(gè)大方向，大框架去獨(dú)自產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。在您設(shè)定的操作步驟里，不乏以下幾步：捕獲抗體的包被（包被的介質(zhì)如：ELISA板、化學(xué)發(fā)光板、磁微粒等）、識(shí)別抗體的標(biāo)記（標(biāo)記手法如：HRP/ALP酶促、HRP/ALP酶發(fā)光、吖啶酯/SA等化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)等）、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/質(zhì)控品等購(gòu)買/制備等，我說(shuō)的這些是最基本的平臺(tái)所涉及的。甚至有些平臺(tái)涉及到放大系統(tǒng)（一般使用生物素放大系統(tǒng)較多）或者上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)等等。說(shuō)了這些，其實(shí)就是一個(gè)目的，在做產(chǎn)品前，先初步制定好自己的平臺(tái)流程，對(duì)應(yīng)的流程里涉及的試劑/物質(zhì)，相應(yīng)的去包被/標(biāo)記/處理等。
做好以上的，那就開(kāi)始您的正式研發(fā)工作吧，將您準(zhǔn)備好的每一種物質(zhì)帶入某個(gè)制定步驟中，初期使用的抗體原料濃度一般有兩種選擇：第一種就是原料商給予的信息，建議濃度范圍，您可以嘗試；第二種就是常規(guī)的按照1ug/ml包被捕獲抗體、1:2000稀釋標(biāo)記抗體，當(dāng)然這些都是經(jīng)驗(yàn)值，不適用于所有產(chǎn)品，具體產(chǎn)品還需要綜合很多信息；比如我經(jīng)歷過(guò)的某些產(chǎn)品，對(duì)應(yīng)的初步使用濃度一個(gè)為15ug/ml（EISPOT平臺(tái)）、一個(gè)為3ug/ml（ELISA平臺(tái)），這些是需要結(jié)合你所使用的平臺(tái)特性以及原料物質(zhì)本身特性決定，綜合信息去考慮去衡定。甚至我做過(guò)的某產(chǎn)品原料用到了1mg/ml濃度（POCT平臺(tái)），雖然濃度高，但單檢測(cè)使用量少。。。。。。這里我就不多說(shuō)了。
在您初步摸索過(guò)的濃度做了技術(shù)流程之后，你極有可能會(huì)遇到很多現(xiàn)象，比如：無(wú)數(shù)值（反應(yīng)孔值與陰性孔值一致）或者全部高值（陰性孔與反應(yīng)孔的數(shù)值一致都為很高的值），諸如此類問(wèn)題的原因排查：
無(wú)數(shù)值，考慮所使用的buffer體系是否合理，孵育時(shí)間，洗板操作等等，導(dǎo)至蛋白在操作過(guò)程中丟失，還有一個(gè)問(wèn)題需要重視，就是位阻問(wèn)題，排查下使用的封閉系統(tǒng)是否存在導(dǎo)至位阻原因的大分子物質(zhì)存在？另外在封閉體系和包被緩沖液中是否存在導(dǎo)至蛋白物質(zhì)與反應(yīng)介質(zhì)去離子化物質(zhì)？各反應(yīng)體系緩沖液的pH值也是一個(gè)很重要的環(huán)節(jié)；
高值，考慮的幾大方面包括：操作是否存在交叉污染？比如洗滌？比如加樣使用槍頭未更換？是否存在洗滌操作不徹底？是否存在洗滌液成分問(wèn)題？等等。
在您基本摸索出反應(yīng)濃度成梯度時(shí)（梯度計(jì)算可一次項(xiàng)直線計(jì)算、也可擬合各種曲線如：二次項(xiàng)、雙對(duì)數(shù)等等，但是每種不同線性有對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)指標(biāo)，可查閱相關(guān)資料），恭喜您，可以進(jìn)入下一步操作，工藝優(yōu)化，即：將您前期所操作的步驟，每一步驟，每一組份，去進(jìn)一步精化操作，最終獲得一個(gè)能夠讓您得到最優(yōu)檢測(cè)結(jié)果的所謂最優(yōu)化操作步驟。這一大塊，我也不累述了。很多細(xì)節(jié)是需要經(jīng)驗(yàn)積累的。但是新手們，只需要記住一個(gè)準(zhǔn)則：在確保自己操作手法的盡量標(biāo)準(zhǔn)外，每一環(huán)節(jié)做到大膽假設(shè)，小心求證即可。并且在研發(fā)工作期間，逐步積累經(jīng)驗(yàn)，遇到細(xì)節(jié)問(wèn)題多問(wèn)多看，多翻閱相關(guān)資料文獻(xiàn)，最終能夠獲得一個(gè)屬于自己特色的研發(fā)思路和體系，而這才是您在研發(fā)之路走得更遠(yuǎn)更久的硬東西！
以上內(nèi)容寫(xiě)的很亂很碎，只是粗略的談下我本人對(duì)于研發(fā)初期的各位戰(zhàn)友的一些想法，希望能夠有點(diǎn)小用處。其實(shí)研發(fā)思路和自身研發(fā)體系，每個(gè)人都是各異的，一個(gè)產(chǎn)品的形成，需要研發(fā)技術(shù)、需要質(zhì)量體系、需要法規(guī)約束等等，這是IVD產(chǎn)品的特色。質(zhì)量體系也好，法規(guī)也罷，其實(shí)他們都是一個(gè)框架、一種約束，約束著產(chǎn)品技術(shù)的合理開(kāi)發(fā)、臨床的合理使用等，但是這僅僅是一個(gè)框架，實(shí)質(zhì)內(nèi)容還是需要研發(fā)人員去填補(bǔ)，至于如何將一個(gè)產(chǎn)品做到豐滿有肉，那就需要各位研發(fā)大大們各顯神通，而這也正是研發(fā)工作人員的目標(biāo)。
此文就當(dāng)是開(kāi)篇吧，后續(xù)若有機(jī)會(huì)，我會(huì)就每一研發(fā)環(huán)節(jié)詳細(xì)聊下研發(fā)體系中可能會(huì)碰到的一些現(xiàn)象及處理方式等，意在能夠與各位研友互動(dòng)。若有不足或錯(cuò)誤之處，敬請(qǐng)批評(píng)指正。研發(fā)之路慢慢兮，研發(fā)同道須上下而求索！
文章來(lái)源:體外診斷資訊網(wǎng)
